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一、原生質(zhì)體概念kV3紅軟基地
二、原生質(zhì)體培養(yǎng)意義：kV3紅軟基地
第一節(jié)   原生質(zhì)體的分離與純化kV3紅軟基地
（四）分離方法kV3紅軟基地
二、原生質(zhì)體的純化kV3紅軟基地
第二節(jié)  原生質(zhì)體培養(yǎng)kV3紅軟基地
二、培養(yǎng)方法kV3紅軟基地
2、平板法培養(yǎng)    原生質(zhì)體（密度為4×105/ml）與等量體積瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合—置于6cm培養(yǎng)皿（2-3mm），暗培養(yǎng)—5-7天原生質(zhì)體開始分裂    特點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，利于分裂，容易獲得單胞株系，可定位觀察。原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎，原生質(zhì)體始終處于高滲透壓脅迫下生長發(fā)育緩慢，植板率低。 kV3紅軟基地
3、懸滴法培養(yǎng)    將含一定密度原生質(zhì)體的懸浮液，滴在6cm培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)上，皿底加入培養(yǎng)液和滲透劑等液體保濕，此時(shí)培養(yǎng)小滴懸掛在皿蓋內(nèi)。   特點(diǎn)：用材少，培養(yǎng)液消耗少，利于通風(fēng)與觀察，可做原生質(zhì)體不同密度的培養(yǎng)對比試驗(yàn)，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。kV3紅軟基地
4、雙層培養(yǎng)法      固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)淺層培養(yǎng)相結(jié)合的方法，效果最佳。原生質(zhì)體采用平板培養(yǎng)方法包埋在培養(yǎng)皿底層，上面再加入相同成分的液體培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)。需更換新鮮液體培養(yǎng)基。      特點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易獲單細(xì)胞株系，能除去抑制分裂的有害物質(zhì)，細(xì)胞植板率高。原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎。 kV3紅軟基地
5、飼喂培養(yǎng)法   將飼喂的細(xì)胞用培養(yǎng)基作平板，此平板稱飼喂層，用X射線或紫外線照射，使核失活但細(xì)胞存活，然后將原生質(zhì)體以液體淺層培養(yǎng)或平板技術(shù)鋪在飼喂層上。   特點(diǎn)：以一種植物細(xì)胞制成的平板，支持另一種植物原生質(zhì)體的生長。飼喂層沒有種的特異性。kV3紅軟基地
三、原生質(zhì)體存活率、密度及產(chǎn)量的測定kV3紅軟基地
（一）雙醋酸鹽熒光素染色法測定存活率   存活率=存活原生質(zhì)體數(shù)/總原生質(zhì)體數(shù)×100kV3紅軟基地
（二）測定原生質(zhì)體的密度   原生質(zhì)體的密度（個(gè)/ml）=（原生質(zhì)體數(shù)/1區(qū)域）×104×稀釋倍數(shù)kV3紅軟基地
（三）原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定                         Y=DV / FW      Y（個(gè)/g）——原生質(zhì)體產(chǎn)量      D（個(gè)/ml）——存活原生質(zhì)體密度      V（ml）——制備所得原生質(zhì)體懸液的總體積      FW（g）——制備原生質(zhì)體所用材料的鮮重kV3紅軟基地
四、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素kV3紅軟基地
1、原生質(zhì)體活力kV3紅軟基地
      選擇生長健康植株上的外植體，或分裂旺盛的愈傷組織或懸浮細(xì)胞，在酶解處理時(shí)酶制劑濃度不要過高。kV3紅軟基地
2、原生質(zhì)體起始密度kV3紅軟基地
      一般起始密度為5000-10000個(gè)/ml，看護(hù)培養(yǎng)可降低培養(yǎng)密度。kV3紅軟基地
3、滲透壓穩(wěn)定劑kV3紅軟基地
      在原生質(zhì)體培養(yǎng)中除用2-3%蔗糖作為穩(wěn)定劑外，還使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或部分取代甘露醇，效果也很高。kV3紅軟基地
五、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素kV3紅軟基地
4、培養(yǎng)基成分kV3紅軟基地
   1）基本培養(yǎng)基：MS，B5，Nitsch、N6、KM-8PkV3紅軟基地
   2）碳源：葡萄糖（大多數(shù)用）kV3紅軟基地
   3）無機(jī)鹽濃度和氮形態(tài)：無機(jī)鹽濃度不宜過高，尤其銨態(tài)氮濃度不宜過高。kV3紅軟基地
   4）植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度配比：kV3紅軟基地
5、培養(yǎng)條件kV3紅軟基地
   光照：原生質(zhì)體培養(yǎng)初期不需要光照，采用暗培養(yǎng)，當(dāng)形成細(xì)胞團(tuán)后在光下培養(yǎng)，強(qiáng)光抑制細(xì)胞分裂kV3紅軟基地
   溫度:26±1℃kV3紅軟基地
6、植物材料和基因型kV3紅軟基地
第三節(jié) 原生質(zhì)體融合kV3紅軟基地
    也稱體細(xì)胞雜交，就是分離下來的不同親本雜交的原生質(zhì)體，在人工控制下，像性細(xì)胞受精作用那樣互相融合成一體。    自然條件下，原生質(zhì)體自然融合頻率極低，必須加以一定的方法誘導(dǎo)，才能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。kV3紅軟基地
二、原生質(zhì)體融合的方法和過程（一）無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合      硝酸鈉（二）聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)劑與高鈣相結(jié)合的誘導(dǎo)融合   1、PEG誘導(dǎo)劑溶液配制：分子量為4000-6000。    2、高Ca2+-高PH液   3、原生質(zhì)體培養(yǎng)基：NT與MSkV3紅軟基地

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